Во втором случае мы можем продолжать нагрев до тех пор, пока не разделятся все фрагменты ДНК, но, вероятно, на практике это потребует таких высоких температур, что сама ДНК и любые другие биологические молекулы окажутся поврежденными.

Как выясняется, цепи ДНК разделяются резко, то есть молекула действительно плавится. Если взять пробирку с ДНК и нагреть ее, молекулы останутся двухнитевыми до достижения определенной температуры плавления, а сразу после ее превышения распадутся на отдельные нити. Мы не просто можем измерить это в лаборатории, но и понимаем, почему так происходит. Выяснение природы фазовых переходов — переходов между твердым, жидким и газообразным состояниями, или между магнитной и немагнитной формами, или между любыми другими альтернативными структурами материалов — стало одним из величайших триумфов физики XX века. Плавление ДНК — это переход от порядка к беспорядку, в целом типичный для всех переходов, но имеющий свои особенности.

Все фазовые переходы отражают конфликт порядка и беспорядка. В основе порядка, как правило, лежит энергия, связанная с притяжением или выравниванием, а беспорядок определяется геометрией — тем, какими способами компоненты могут располагаться в пространстве. Повышение температуры многократно усиливает позиции беспорядка. При низкой температуре побеждает стремление к порядку, при высокой беспорядок берет верх. Так, в холоде молекулы воды выстраиваются в кристаллическую решетку льда, а когда теплеет, их положение в пространстве характеризуется типичной для жидкости хаотичностью. Утверждение, что плавление представляет собой резкий переход от одного состояния к другому, означает существование специфической температуры, разделяющей их, то есть четкой границы между фазами порядка и беспорядка.

Энергия упорядочения и разновидности беспорядка зависят от того, какие измерения может осваивать вещество. Последствия фазовых переходов драматичны, и в общем случае теория не предсказывает резкого перехода одномерных материалов из одной фазы в другую. Так, цепочка из молекул воды не должна расплавиться вдруг в какой-то точке температурной кривой: беспорядок возникнет уже при самой низкой из возможных температур и будет неуклонно усиливаться с ее повышением.

С приличной долей приближения можно сказать, что протяженная двухцепочечная ДНК одномерна — как идущие одна за другой ступеньки на приставной лестнице. Следовательно, ее резкое плавление, наблюдаемое в лаборатории, вроде бы противоречит ожиданиям. Однако, когда нити расцепляются, высвобожденная одноцепочечная ДНК изгибается и скручивается в трех измерениях (см. рисунок) под действием случайных сил, влияющих на все молекулы, которые мы обсудим в этой книге. Хотя движения нитей случайны, их последствия стабильны и предсказуемы (с подобным мы не раз еще столкнемся): благодаря конечной конфигурационной свободе полное их разделение происходит при фиксированной температуре перехода, как это свойственно трехмерным материалам. Располагая экспериментальными данными и теоретическим обоснованием, мы можем даже спрогнозировать температуру, при которой разделится та или иная молекула ДНК. Обычно температура перехода составляет около 95 °C, что чуть ниже температуры кипения воды, но точное значение сильно зависит от нуклеотидной последовательности.

Итак, мы можем разделить нити ДНК в пробирке, просто нагрев ее. Если мы хотим реплицировать эту ДНК, далее необходимо построить комплементарные последовательности к каждой из нитей. Для этого мы можем позаимствовать у природы инструмент, рутинно применяемый нашими клетками, — фермент ДНК-полимеразу. Однако при температуре плавления ДНК обычные белки превратятся в бесполезную резиноподобную массу наподобие вареного яичного белка (который в сухом остатке и состоит главным образом из белка). Биологам пришлось найти хитрый способ этого избежать: мы применяем ДНК-полимеразы из бактерий, живущих в горячих источниках, поскольку белки этих организмов в ходе эволюции приспособились исправно работать при высокой температуре. При этом важно, что для начала репликации нити ДНК любой полимеразе необходим хотя бы небольшой двухнитевой участок молекулы (см. рисунок ниже). Бактериологи обнаружили и очистили термостабильную полимеразу в 1976 году, и к началу 1980-х все ингредиенты оказались в сборе. В 1983 году рецепт, в котором сочетаются нуклеотиды, полимеразы, молекулы ДНК и температура, пришел в голову ученому Кэри Муллису, когда он ночью ехал вдоль Берегового хребта Калифорнии5. Вместе с рецептом пришло и осознание, что так открывается дорога к простой и почти безграничной репликации ДНК. Сегодня этот процесс называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР [История открытия метода, его суть, вариации и применения подробно и популярно описаны, например, в статье «12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция» (https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia). // «— А это помещение почему у вас пустует? — спрашивает Калдымов. // — Здесь стояли быки, — отвечает Орлов, — но мы их вывели сейчас отсюда. Крыша течет, углы промерзли, да и балки прогнили, небезопасно оставлять скот. Будем капитально ремонтировать. // — Не стоит на такую рухлядь гробить средства. Лучше пустите под барак для женщин… // — Что вы, товарищ директор! Ведь даже быки не выдержали, хворать здесь стали. // — Так то — быки! Быками, конечно, рисковать не будем» (Гинзбург 2021, 451). // Даже «падёж» (степень дегуманизации, предполагающая, что подвергшийся расчеловечиванию не может даже умереть, а может только околеть) — центральная метафора одноименной повести Сорокина — как образ как будто заимствован из «Крутого маршрута». Это наводит на мысль о том, что «искра совести» подверглась порче не только в мире рассказа «толстой-4», но и в нашем так называемом реальном мире.].

Чтобы провести ПЦР, первым делом мы вносим в деионизованную воду со специальным солевым раствором (буфером) все ингредиенты: небольшое количество ДНК, которую мы хотим реплицировать [Если исходная молекула ДНК — та, что будет служить матрицей для синтеза новых цепей, — очень длинная, целиком ее копировать невозможно. Обычно на основе крупной матрицы намножают (амплифицируют) небольшие фрагменты ДНК.]; ДНК-полимеразу; отдельные нуклеотиды (A, Ц, Г и T) в большом количестве и праймеры — в достаточном. Праймеры, или затравки, представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (обычно не длиннее 30 нуклеотидов), комплементарные концам копируемого участка ДНК. Мелкие детальки, разбросанные по рисункам, — это праймеры (они подлиннее) и нуклеотиды (они покороче).

Далее мы повышаем температуру примерно до 95 °C, чтобы расплавить ДНК и из исходной двойной спирали получить две отдельные нити.

После этого мы понижаем температуру, чтобы праймеры связались с соответствующими концами однонитевых ДНК. Праймеров много, поэтому матричная однонитевая ДНК с гораздо большей вероятностью наткнется на праймер, чем на свою бывшую партнерскую нить: предсказуемая случайность работает на нас. Далее полимераза «садится» на ДНК-матрицу и наращивает конец праймера подходящими нуклеотидами, звено за звеном синтезируя комплементарную нить. После завершения процесса мы получаем две двойных спирали ДНК, созданные по шаблону одной исходной.

Затем мы повторяем цикл нагревания, охлаждения и синтеза, что дает нам уже 4 молекулы ДНК; в последующих циклах мы получим 8, 16, 32, 64… Соответственно, 10 удвоений даст нам 1024 молекулы, 20 — миллион, 30 (что вполне позволяют автоматизированные приборы для ПЦР — амплификаторы, или термоциклеры) — более миллиарда! [Очевидно, что синтезированные копии ДНК тоже служат матрицами для построения новых молекул, однако амплификация в одной смеси не может длиться вечно: запас рабочей полимеразы, например, истощается примерно к 30-му циклу, и если необходимо, эту же ПЦР-смесь сильно разбавляют, внося новые ингредиенты, кроме исходной ДНК.]

Следовательно, ничтожное количество ДНК мы можем превращать во множество идентичных молекул, тем самым как бы усиливая шепот до громкого хора реплик, который можно на любой вкус применять в медицинской диагностике, терапии и криминалистике. В живых организмах копирование ДНК происходит только в качестве элемента замысловатого репродуктивного танца, порождающего совершенно новую клетку или даже организм. Полимеразная цепная реакция позволяет копировать ДНК по нашему желанию. Рецепт ее прекрасен в своей простоте. Сам Муллис писал, что, узнав о его изобретении, молекулярные биологи «чуть ли не всегда первым делом произносили: `И почему же я до этого не додумался?'«Муллис отвечал на это так: «И никто на самом деле не знает почему; я уж точно не знаю. Однажды ночью эта мысль просто врезалась мне в голову».

Приручив репликацию ДНК, мы можем создавать достаточное количество копий для секвенирования генома — установления точного порядка нуклеотидов в нем с помощью техник, которые мы опишем в части III. Этот подход позволил нам картировать геномы человека и многих других организмов.

Поскольку для ПЦР нужны праймеры, которые создают необходимый для полимеразы короткий двухнитевой участок ДНК и прикрепляются только к комплементарной им нуклеотидной последовательности, у вас может возникнуть вопрос, не должны ли мы тогда заранее знать, какую последовательность амплифицируем. Нет, это не обязательно. Прежде всего для каких-то целей достаточно знать лишь часть генома организма, с ДНК которого мы работаем, и тогда можно конструировать праймеры, прикрепляющиеся именно к этой части. В большинстве же случаев мы можем нарезать неизвестную ДНК на фрагменты и встроить их в хорошо знакомую нам ДНК, например в специальные элементы генома легко выращиваемых бактерий [Этот процесс известен как молекулярное клонирование: амплифицируемую или исследуемую ДНК встраивают в векторы — генетически подправленные для той или иной цели небольшие молекулы ДНК (реже РНК) вирусного, бактериального или эукариотического происхождения. Для множества задач подходят, например, векторы на основе бактериальных плазмид (внехромосомных генетических элементов, способных реплицироваться в бактериях самостоятельно). Векторы защищают встроенный в них генетический материал от разрушения, помогают размножить его и изучить, доставить в нужный тип клеток, синтезировать на его основе полезные белки.]. Для этого мы используем встречающиеся в природе белки, которые сшивают нити ДНК. В таком варианте праймеры, комплементарные известной ДНК, направят ДНК-полимеразу на неизвестные части. Именно так «прочитали», например, выделенный из древних останков геном шерстистого мамонта, вымершего несколько тысяч лет назад.

Полимеразная цепная реакция стала неотъемлемой частью решения почти всех задач, связанных с ДНК. При этом сама она обеспечивается совмещением биологических редкостей (вроде термофильных микроорганизмов) с физическими универсалиями (вроде такого фазового перехода, как плавление), хотя по отдельности они могут казаться слабо связанными с практическими задачами. Кроме того, ПЦР наглядно подкрепляет тезис, ключевой для многих современных технологий и природных процессов: ДНК — это не просто код, не какая-то абстракция, а вполне осязаемый физический объект. Руководствуясь прежде всего принципами самосборки и прогнозируемой случайности, мы можем обосновывать и даже изобретать методы работы с этой важнейшей молекулой.